Vzorky na koronavirus se ve Fakultní nemocnici Brno zpracovávají v laboratoři Oddělení klinické mikrobiologie a dominantně zejména v laboratoři Centra molekulární biologie a genové terapie (CMBGT) při Interní hematologické a onkologické klinice FN Brno a LF MU v Dětské nemocnici. Od začátku testování 19. 3. 2020 tam zpracovali více než 6 000 vzorků. Vyhodnocování vzorků popsala v níže uvedeném textu doc. Mgr. Martina Lengerová, Ph.D., vedoucí pracovník Centra molekulární biologie a genové terapie.
Vzorky z areálu Bohunice do laboratoře přijíždí čtyřmi denními svozy, cca v 6:30, 8:30, 13:00 a 16:30. Vzorky z Dětské nemocnice přinášejí sanitáři průběžně během dne, jak jsou odebírány. Na jejich zpracování se podílí 4 týmy po dvou lidech (příjem vzorků, izolace RNA, provedení a vyhodnocení RT-PCR, administrativa), kteří se v pracovních dnech střídají na dvou směnách (od 6:00 cca do 22:30).
Po přijetí vzorků je nutné zkontrolovat údaje na žádankách, ty přiřadit k jednotlivým patronám a vzorky i patrony označit štítky s číslem, pod kterým bude vzorek v laboratoři evidovaný po celou dobu zpracování.
Po této rychlé identifikaci jsou vzorky ihned rozepisovány podle jejich priority (P1 až P5) na seznamy pro zpracování na jednotlivých automatických izolátorech, optimálně v sadách po 12, 16 nebo 24 vzorcích. Jednotlivé izolátory se liší nejen svojí kapacitou, ale také dobou nutnou pro izolaci RNA (40 – 80 minut). Ty nejrychlejší mají nejmenší kapacitu, proto je nutné pečlivě zvážit pořadí vzorků s ohledem na požadovanou dobu odezvy. Kapacitou izolátorů je do velké míry dán počet vzorků, které mohou být v laboratoři za den zpracovány.
Vzorky musí být skladovány ideálně neustále při teplotě 2-8°C. Proto jsou z příjmové laboratoře ihned po očíslování přesunuty do lednice. Všechny další kroky se odehrávají v uzavřené laboratoři s režimem BSL-2 za hygienickou smyčkou. Prvním úkonem je vybalení vzorků z patron, jejich opětovná identifikace a polepení štítky s číslem. Pak se ihned zpracovávají (STATIM) nebo ukládají do stojánků a čekají, až na ně přijde řada.
Veškerá manipulace se vzorky se provádí v kompletních ochranných pomůckách (ústenka, štít, plášť a rukavice). Je třeba dodržovat přísná pravidla, aby nedošlo ke kontaminaci pracovníků, prostředí (kliky, lednice…) nebo přístrojů. To by vedlo nejen k možnému ohrožení zdraví ostatních, ale také by ohrozilo další analýzy – např. při kontaminaci přístrojů pozitivním vzorkem by hrozila falešná pozitivita u všech následujících vzorků.
Po vybalení vzorků je nutné patrony zevnitř i zvenku dekontaminovat a připravit k odvozu na Centrální sterilizaci, kde budou připraveny a dalšímu použití.
Pro vlastní izolaci RNA máme nyní k dispozici 3 různé automatické izolátory se dvěma různými principy izolace (buď kolonková centrifugační metoda nebo izolace na magnetických kuličkách).
Vzorky se do nich vkládají otevřené, je nutná velmi opatrná manipulace. Přístroje jsou proto také umístěny v uzavřených laboratořích. Jejich obsluha připraví vzorky odpipetováním z odběrových zkumavek do zkumavek, ve kterých se vkládají do přístroje. Dále pak doplní potřebné roztoky a spotřební materiál („cartridge“ s reagenciemi, špičky a označené zkumavky pro izolovanou RNA) a spustí vlastní izolaci. Zároveň oznamuje telefonicky „PCR týmu“ kdy budou RNA připravené pro další analýzy. Vyizolovaná RNA už není „infekční“ a další práce se přesouvá do běžných laboratoří.
Pro provedení RT-PCR (reverzně-transkripční PCR; vysoce citlivá metoda pro vyhledání konkrétní virové RNA v celkové RNA získané z klinického vzorku) máme k dispozici plně automatický robotický systém pro současnou analýzu 24 vzorků nebo několik běžných přístrojů pro real-time RT-PCR. U prvního je potřeba osadit přístroj vzorky RNA, potřebnými reagenciemi a spotřebním materiálem. Ostatní úkony, včetně vyhodnocení, provede víceméně sám. Jeho výhodou je tedy krátký hands-on-time, vysoká citlivost a automatické vyhodnocení, nevýhodu je poměrně nízká kapacita (24 vzorků za necelé 3 hodiny), proto se používá pro analýzy nestatimových vzorků.
Příprava klasické RT-PCR se provádí ve speciálním PCR boxu a trvá cca 20-30 minut, podle počtu vzorků. Lidskou chybu při sestavování PCR se snažíme eliminovat pečlivým monitorováním činnosti každého pracovníka.
Každopádně výsledky RT-PCR jsou k dispozici za 2-3 hodiny (od převzetí RNA), podle použité technologie. Pod tento čas nelze dobu analýzy zkrátit. Po provedení každé RT-PCR jsou výsledky ihned vyhodnoceny, generujeme je průběžně během celého dne.
Na pozadí všech těchto výše popsaných činností celou dobu funguje tým administrátorů, který:
- Eviduje zaslané žádanky do elektronické podoby.
- Monitoruje, v jaké fázi zpracování se vzorky nachází.
- U vyhodnocených výsledků tyto ihned zapisuje a hlásí na příslušná oddělení, Krajskou hygienickou stanici, urgentní příjem, OKINH a následně do systému ISIN pod ÚZIS… V případně negativních výsledků z „drive-in“ stanů hlásí výsledky formou SMS přímo pacientům.
- Chystá papírové zprávy (např. pro překlady do jiných nemocničních zařízení apod.),
- Přijímá požadavky na přeřazení vzorků na jinou prioritu a další.
- A také trpělivě odpovídá na vaše telefonické dotazy.
Předáním výsledků celý proces pozdě večer končí a další den jedeme znovu!
Tým laboratoře CMBGT
