Menu
Česky English Deutsch
+420 532 23 1111

Laboratoř molekulární diagnostiky

 

Vedoucí laboratoře: RNDr. Iveta Valášková, Ph.D., tel. 532234715, 4718

 

Laboratoř molekulární diagnostky provádí vysoce specializovanou molekulárně genetickou diagnostiku u nemocných s dědičnými chorobami a v jejich rodinách s využitím širokého spektra metod molekulární genetiky.

 

Laboratoř  zajišťuje izolaci lidské genomové DNA z krve, tkání, nebo buněk po kultivaci a její dlouhodobé uchování v DNA bance OLG. Provádí DNA analýzu vybraných genů, u nichž přesně identifikuje patologické změny genetického materiálu a určuje původ chorob na molekulární úrovni . Provádí vysoce specializovaná molekulárně genetická vyšetření maligních onemocnění kvalitativní a kvantitavní analýzou diagnosticky a prognosticky významných molekulárních onkologických markerů

 


Laboratoř je zapojena do národní a mezinárodní mezilaboratorní kontroly kvality a pracuje podle evropských standardů. Pracovníci laboratoře se účastní řešení výzkumných úkolů a záměrů. V rámci výzkumných projektů jsou zaváděny nové molekulárně genetické metody, analýza nových genů, získávány poznatky umožňující přesnější interpretaci molekulárně genetických analýz v souladu s aktuálními poznatky molekulární biologie a genetiky. Laboratoř sleduje rychlý vývoj molekulárně genetických vyšetřovacích metod a v týmové spolupráci je uvádí do praxe.

 

Používané molekulárně genetické metody

  • Izolace DNA – vysolovací metoda, izolace pomocí kitu a s využitím izolátoru MagnaPure Roche
  • Izolace RNA a zpětný přepis do cDNA
  • Polymerázová řetězová reakce (PCR)
  • Real-time PCR
  • High Resolution Melting Analysis (HRM)
  • Denaturační gradientová elektroforéza (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis -DGGE)
  • Jednořetězcový konformační polymorfismus (Single Strand Conformation Polymorphism - SSCP)
  • Sekvenování
  • Fragmentační analýza
  • MLPA - Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification
  • Hybridizace pomocí INNO-LiPA
  • Kvantitativní fluorescenční PCR (QF PCR)
  • Direct QF-PCR
  • Vazebná analýza
  • Metylační analýza

 

Monogenně dědičné choroby

Vznik monogenně dědičných chorob je podmíněn mutací jediného genu. Tato onemocnění mohou být recesivní (například cystická fibróza) nebo dominantní (neurofibromatóza I).

V laboratoři molekulární diagnostiky jsou takto postižení pacienti a jejich příbuzní nebo partneři vyšetřováni s využitím široké palety doplňujících se metod.

 

Seznam molekulárně genetických vyšetření

 

Cystická fibróza

gen CFTR

F508del, G542X, G551D, R553X,

CFTRdele2,3(21kb), N1303K

F508del, G542X, G551D, R553X,

CFTRdele2,3(21kb),N1303K, R117H

36 mutací INNO-LiPACFTR19, INNO-LiPACFTR17+Tn

50 mutací ELUCIGENE

scoring mutace…………

scanning kódující oblasti

IVS8polyT-TG

vyhledávání velkých delecí pomocí MLPA analýzy

vazebná analýza

Neurofibromatóza typu 1

gen NF1

scanning kódujcí oblasti na úrovni DNA a RNA

vyhledávání velkých delecí pomocí MLPA analýzy

vazebná analýza

Neurofibromatóza typu 2

gen NF2

scanning kódujcí oblasti na úrovni DNA a RNA

vyhledávání velkých delecí pomocí MLPA analýzy

Rhabdoid predispoziční syndrom

gen INI 1

mutační scaning na úrovni DNA

Duchennova svalová dystrofie

gen dystrofin

vyhledávání velkých delecí pomocí MLPA analýzy

vazebná analýza

Hemofilie A

gen pro faktor VIII

inv1 a inv22

scanning kódující oblasti

vazebná analýza

Hemofilie B

gen pro faktor IX

 

scanning kódující oblasti

Delece azospermatického faktoru

AZF

delece AZF a, b, c

Určení pohlaví

SRY, amelogenin

PCR a následná kontrola na PAGE

Myotonická dystrofie typu 1

gen MD1

detekce expanze (CTG)n pomocí metody Triplet Primed PCR

Hluchota

gen GFB2

mutační scanning na úrovni DNA

Chronická pankreatitida

gen CFTR

viz cystická fibróza

gen SPINK1

N34S,L14P,P55S,53C>T

scanning kódující oblasti

gen PRSS1

R122H,K23R,N29I

scanning kódující oblasti

Syndrom dlouhého QT intervalu

 

gen KCNQ1

mutační DNA analýza

gen KCNH2

mutační DNA analýza

gen KCNE1

mutační DNA analýza

Cytochrom P450

gen CYP2D6

 

mutační screening na úrovni DNA

real-time PCR pro alely 3* 4* 6* 7* a 8*

agarová elektroforéza pro detekci genových duplikací, velkých delecí a inverzí

Maligní hypertermie

gen RYR1

mutační screening RYR1 genu na úrovni DNA

mutační screening RYR1 na úrovni RNA

 

real time PCR exonů 17, 39, 40, 44 genu RYR1

gen CACNA1S

analýza křivek tání s vysokým rozlišením (HRM) exonu 11 genu CACNA1S

Deficit MCAD

detekce nejčastější mutace A985G

Lerri-Weil dyschondrosteóza

gen SHOX

MLPA

mutační scaning na úrovni DNA

Metylace promotoru-06-metylguanin-DNA-metyltransferázy

gen MGMT

metylační sekvenování

Katecholaminergní polymorfní ventrikulární tachykardie

gen RYR2

mutační screening na úrovni DNA

Vyšetření volné fetální DNA z krve matky

Určení pohlaví

Určení Rh faktoru

Detekce nejčastější mutace v genu FGFR3, která je příčinou achondroplázie.

 

Onkologická problematika

Při vzniku nádorového onemocnění jsou rozhodující mutace, které postihují geny účastnící se řízení růstu a proliferace buněk („gatekeepers“), případně geny, jejichž úkol spočívá v  udržení neporušenosti genomu („caretakers“). Náchylnost k nádorovému onemocnění může být dále ovlivněna mutacemi v genech zodpovědných za metabolické přeměny karcinogenů, se kterými se organismus neustále setkává. Dále jsou analyzovány nádorové markery,  které jsou přítomny v organismu v důsledku vzniku a vývoje maligního procesu. Jejich analýza je důležitá pro posuzování rozsahu a hlavně další dynamiky v rámci sledování efektu terapie nebo návratu choroby.

 

 

Retinoblastom

gen RB1

mutační scanning na úrovni DNA i RNA

MLPA

analýza metylace promotorové oblasti

Analýza exprese onkologických markerů

TH, TrkA, TrkB, TrkC, cMyc, PGP9.5, p73, MAGE, GAGE, VEGF

Real-time PCR

Synoviální sarkom

SYT/SSX 1,2

detekce exprese fuzního genu SYT/SSX 1,2

p53

mutační DNA analýza

 

Detekce aneuploidií

Aneuploidie znamená odchylku od normálního počtu chromosomů, kterých je u člověka 46. Stanovení správného počtu chromozomů má velký význam při vyšetřeních plodů v průběhu těhotenství, kdy odchylky mohou znamenat postižení vyvíjejícího se plodu nebo časné spontánní potraty.

Klasickou genetickou metodou uplatňující se v prenatální diagnostice je karyotypování. Karyotypování umožňuje analyzovat všechny chromosomy daného jedince a odhalit tak početní a strukturální odchylky chromozomů. Velkou nevýhodou této metody je doba potřebná ke kultivaci, přibližně 14 dní. Kultivace nemusí být ve všech případech úspěšná a doba k tomu potřebná zvyšuje úzkost matky z očekávání výsledků vyšetření.

Novější metodou je kvantitativní fluorescenční polymerázová řetězová reakce (QF PCR). Využívá stejný materiál jako klasické cytogenetické metody, ale je podstatně rychlejší. Při použití této techniky je výsledek k dispozici tentýž nebo následující pracovní den. Metoda však analyzuje pouze nejčastější aneuploidie tzn. aneuploidie chromozomu 13, 18, 21, X a Y a u potracených plodů je schopna dále analyzovat chromozomy 15, 16 a 22.

 

Naše laboratoř vytvořila spojením přístupů direct PCR (nevyžaduje izolaci DNA), fast PCR a QF-PCR novou testovací sadu, která umožňuje určení aneuploidie chromosomu 21 do tří hodin.

 

 

Aneuploidie chr. 13, 18, 21, X, Y

QF-PCR Devyser Complete

Aneuploidie chr. 13, 15, 16, 18, 21, 22, X, Y

QF-PCR Devyser Extend

Aneuploidie chr. 21  

Direct QF-PCR

 

Vyšetření volné DNA plodu v krvi matky

Volná fetální DNA je rozptýlená v plazmě matky a její koncentrace se postupně zvyšuje (v I. trimestru do 3 % , ve III. trimestru až 6 %) a po porodu rychle mizí z cirkulace (po císařském řezu za 4 – 30 min., po vaginálním porodu za 10 – 100 hodin.

 

Neinvazivní vyšetření plodu z volné fetální DNA

  • stanovení pohlaví plodu 
  • stanovení RhD

 

Kontrola kvality laboratoře

V laboratoři jsou uplatňovány zásady správné laboratorní práce včetně systému vnitřní kontroly kvality.

Laboratoř molekulární diagnostiky se pravidelně účastní cyklů externí kontroly kvality, které v ČR organizuje ÚHKT Praha. Laboratoř je dále zapojena do mezinárodního systému kontroly kvality The European Molecular Genetics Quality Network (EMQN) Scheme  for Microdeletions of the Y chromosome  a External Quality Assessment Scheme  for Cystic Fibrosis.  Pro všechny v laboratoři používané metodické postupy je každoročně prováděna mezilaboratorní kontrola.

 

Informace o pohotovosti v Brně a Jihomoravském kraji