Vedoucí laboratoře: RNDr. Iveta Valášková, Ph.D., tel. 532234715, 4718
Laboratoř molekulární diagnostky provádí vysoce specializovanou molekulárně genetickou diagnostiku u nemocných s dědičnými chorobami a v jejich rodinách s využitím širokého spektra metod molekulární genetiky.
Laboratoř zajišťuje izolaci lidské genomové DNA z krve, tkání, nebo buněk po kultivaci a její dlouhodobé uchování v DNA bance OLG. Provádí DNA analýzu vybraných genů, u nichž přesně identifikuje patologické změny genetického materiálu a určuje původ chorob na molekulární úrovni . Provádí vysoce specializovaná molekulárně genetická vyšetření maligních onemocnění kvalitativní a kvantitavní analýzou diagnosticky a prognosticky významných molekulárních onkologických markerů
Laboratoř je zapojena do národní a mezinárodní mezilaboratorní kontroly kvality a pracuje podle evropských standardů. Pracovníci laboratoře se účastní řešení výzkumných úkolů a záměrů. V rámci výzkumných projektů jsou zaváděny nové molekulárně genetické metody, analýza nových genů, získávány poznatky umožňující přesnější interpretaci molekulárně genetických analýz v souladu s aktuálními poznatky molekulární biologie a genetiky. Laboratoř sleduje rychlý vývoj molekulárně genetických vyšetřovacích metod a v týmové spolupráci je uvádí do praxe.
Používané molekulárně genetické metody
- Izolace DNA – vysolovací metoda, izolace pomocí kitu a s využitím izolátoru MagnaPure Roche
- Izolace RNA a zpětný přepis do cDNA
- Polymerázová řetězová reakce (PCR)
- Real-time PCR
- High Resolution Melting Analysis (HRM)
- Denaturační gradientová elektroforéza (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis -DGGE)
- Jednořetězcový konformační polymorfismus (Single Strand Conformation Polymorphism - SSCP)
- Sekvenování
- Fragmentační analýza
- MLPA - Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification
- Hybridizace pomocí INNO-LiPA
- Kvantitativní fluorescenční PCR (QF PCR)
- Direct QF-PCR
- Vazebná analýza
- Metylační analýza
Monogenně dědičné choroby
Vznik monogenně dědičných chorob je podmíněn mutací jediného genu. Tato onemocnění mohou být recesivní (například cystická fibróza) nebo dominantní (neurofibromatóza I).
V laboratoři molekulární diagnostiky jsou takto postižení pacienti a jejich příbuzní nebo partneři vyšetřováni s využitím široké palety doplňujících se metod.
Seznam molekulárně genetických vyšetření
gen CFTR | F508del, G542X, G551D, R553X, CFTRdele2,3(21kb), N1303K |
F508del, G542X, G551D, R553X, CFTRdele2,3(21kb),N1303K, R117H | |
36 mutací INNO-LiPACFTR19, INNO-LiPACFTR17+Tn | |
50 mutací ELUCIGENE | |
scoring mutace………… | |
scanning kódující oblasti | |
IVS8polyT-TG | |
vyhledávání velkých delecí pomocí MLPA analýzy | |
vazebná analýza | |
gen NF1 | scanning kódujcí oblasti na úrovni DNA a RNA |
vyhledávání velkých delecí pomocí MLPA analýzy | |
vazebná analýza | |
gen NF2 | scanning kódujcí oblasti na úrovni DNA a RNA |
vyhledávání velkých delecí pomocí MLPA analýzy | |
Rhabdoid predispoziční syndrom gen INI 1 | mutační scaning na úrovni DNA |
gen dystrofin | vyhledávání velkých delecí pomocí MLPA analýzy |
vazebná analýza | |
gen pro faktor VIII | inv1 a inv22 scanning kódující oblasti vazebná analýza |
Hemofilie B gen pro faktor IX |
scanning kódující oblasti |
Delece azospermatického faktoru AZF | delece AZF a, b, c |
SRY, amelogenin | PCR a následná kontrola na PAGE |
gen MD1 | detekce expanze (CTG)n pomocí metody Triplet Primed PCR |
gen GFB2 | mutační scanning na úrovni DNA |
gen CFTR | viz cystická fibróza |
gen SPINK1 | N34S,L14P,P55S,53C>T |
scanning kódující oblasti | |
gen PRSS1 | R122H,K23R,N29I |
scanning kódující oblasti | |
| |
gen KCNQ1 | mutační DNA analýza |
gen KCNH2 | mutační DNA analýza |
gen KCNE1 | mutační DNA analýza |
gen CYP2D6
| mutační screening na úrovni DNA |
real-time PCR pro alely 3* 4* 6* 7* a 8* | |
agarová elektroforéza pro detekci genových duplikací, velkých delecí a inverzí | |
gen RYR1 | mutační screening RYR1 genu na úrovni DNA |
mutační screening RYR1 na úrovni RNA | |
| real time PCR exonů 17, 39, 40, 44 genu RYR1 |
gen CACNA1S | analýza křivek tání s vysokým rozlišením (HRM) exonu 11 genu CACNA1S |
detekce nejčastější mutace A985G | |
Lerri-Weil dyschondrosteóza gen SHOX | MLPA |
mutační scaning na úrovni DNA | |
Metylace promotoru-06-metylguanin-DNA-metyltransferázy gen MGMT | metylační sekvenování |
Katecholaminergní polymorfní ventrikulární tachykardie gen RYR2 | mutační screening na úrovni DNA |
Vyšetření volné fetální DNA z krve matky Určení pohlaví Určení Rh faktoru | Detekce nejčastější mutace v genu FGFR3, která je příčinou achondroplázie. |
Onkologická problematika
Při vzniku nádorového onemocnění jsou rozhodující mutace, které postihují geny účastnící se řízení růstu a proliferace buněk („gatekeepers“), případně geny, jejichž úkol spočívá v udržení neporušenosti genomu („caretakers“). Náchylnost k nádorovému onemocnění může být dále ovlivněna mutacemi v genech zodpovědných za metabolické přeměny karcinogenů, se kterými se organismus neustále setkává. Dále jsou analyzovány nádorové markery, které jsou přítomny v organismu v důsledku vzniku a vývoje maligního procesu. Jejich analýza je důležitá pro posuzování rozsahu a hlavně další dynamiky v rámci sledování efektu terapie nebo návratu choroby.
Retinoblastom gen RB1 | mutační scanning na úrovni DNA i RNA |
MLPA | |
analýza metylace promotorové oblasti | |
Analýza exprese onkologických markerů TH, TrkA, TrkB, TrkC, cMyc, PGP9.5, p73, MAGE, GAGE, VEGF | Real-time PCR |
SYT/SSX 1,2 | detekce exprese fuzního genu SYT/SSX 1,2 |
mutační DNA analýza |
Detekce aneuploidií
Aneuploidie znamená odchylku od normálního počtu chromosomů, kterých je u člověka 46. Stanovení správného počtu chromozomů má velký význam při vyšetřeních plodů v průběhu těhotenství, kdy odchylky mohou znamenat postižení vyvíjejícího se plodu nebo časné spontánní potraty.
Klasickou genetickou metodou uplatňující se v prenatální diagnostice je karyotypování. Karyotypování umožňuje analyzovat všechny chromosomy daného jedince a odhalit tak početní a strukturální odchylky chromozomů. Velkou nevýhodou této metody je doba potřebná ke kultivaci, přibližně 14 dní. Kultivace nemusí být ve všech případech úspěšná a doba k tomu potřebná zvyšuje úzkost matky z očekávání výsledků vyšetření.
Novější metodou je kvantitativní fluorescenční polymerázová řetězová reakce (QF PCR). Využívá stejný materiál jako klasické cytogenetické metody, ale je podstatně rychlejší. Při použití této techniky je výsledek k dispozici tentýž nebo následující pracovní den. Metoda však analyzuje pouze nejčastější aneuploidie tzn. aneuploidie chromozomu 13, 18, 21, X a Y a u potracených plodů je schopna dále analyzovat chromozomy 15, 16 a 22.
Naše laboratoř vytvořila spojením přístupů direct PCR (nevyžaduje izolaci DNA), fast PCR a QF-PCR novou testovací sadu, která umožňuje určení aneuploidie chromosomu 21 do tří hodin.
Aneuploidie chr. 13, 18, 21, X, Y | |
Aneuploidie chr. 13, 15, 16, 18, 21, 22, X, Y | QF-PCR Devyser Extend |
Aneuploidie chr. 21 |
Vyšetření volné DNA plodu v krvi matky
Volná fetální DNA je rozptýlená v plazmě matky a její koncentrace se postupně zvyšuje (v I. trimestru do 3 % , ve III. trimestru až 6 %) a po porodu rychle mizí z cirkulace (po císařském řezu za 4 – 30 min., po vaginálním porodu za 10 – 100 hodin.
Neinvazivní vyšetření plodu z volné fetální DNA
- stanovení pohlaví plodu
- stanovení RhD
Kontrola kvality laboratoře
V laboratoři jsou uplatňovány zásady správné laboratorní práce včetně systému vnitřní kontroly kvality.
Laboratoř molekulární diagnostiky se pravidelně účastní cyklů externí kontroly kvality, které v ČR organizuje ÚHKT Praha. Laboratoř je dále zapojena do mezinárodního systému kontroly kvality The European Molecular Genetics Quality Network (EMQN) Scheme for Microdeletions of the Y chromosome a External Quality Assessment Scheme for Cystic Fibrosis. Pro všechny v laboratoři používané metodické postupy je každoročně prováděna mezilaboratorní kontrola.